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Normative Cee
Allegato VI
Determinazione dell'eritrodiolo e dell'uvaolo

 

1. OGGETTO
Il metodo descrive il procedimento per la determinazione dell'eritrodiolo nelle sostanze grasse.

2. PRINCIPIO DEL METODO
La sostanza grassa viene saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi si estrae l'insaponificabile con etere etilico e lo si purifica per passaggio su colonna di allumina. Si procede al frazionamento dell'insaponificabile mediante cromatografia su strato sottile su placca di gel di silice e si isolano la banda della frazione sterolica e quella dell'eritrodiolo. Gli steroli e l'eritrodiolo, recuperati dalla placca vengono trasformati in trimetilsilileteri, la miscela è quindi analizzata mediante gascromatografia. Il risultato è espresso in percento di eritrodiolo rispetto all'insieme eritrodiolo + steroli.

3. APPARECCHIATURA
 

3.1. Apparecchiature prescritte nel metodo all'allegato V (Determinazione del contenuto degli steroli).
 

4. REAGENTI
 

4.1. Reagenti prescritti nel metodo all'allegato V (determinazione del contenuto degli 

       steroli).

4.2. Soluzione di riferimento di eritrodiolo, allo 0,5 % in cloroformio.

 

5. PROCEDIMENTO
 

5.1. Preparazione dell'insaponificabile.
       Si procede come descritto al paragrafo 5.1.2. del metodo all'allegato V.

5.2. Separazione dell'eritrodiolo e degli steroli.

5.2.1. Vedi paragrafo 5.2.1. del metodo all'allegato V.

5.2.2. Vedi paragrafo 5.2.2. del metodo all'allegato V.

5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % in cloroformio dell'insaponificabile.

Con la microsiringa da 0,1 ml, si depositano su una placca cromatografica, a circa 1,5 cm dal bordo inferiore, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. Ad una estremità della placca si depositano, come riferimento, alcuni microlitri delle soluzioni di colesterolo e di eritrodiolo.

5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto al paragrafo

5.2.1. La temperatura ambiente deve essere di circa 20°C. Si chiude subito col coperchio e si eluisce fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda.

 5.2.5. Si spruzza la placca uniformemente con la soluzione alcolica di 2', 7' -

diclorofluoresceina. Esaminando la placca alla luce ultravioletta si individuano le bande degli steroli e dell'eritrodiolo in base all'allineamento con i riferimenti, e si delimitano con una punta leggermente al di fuori dei margini di fluorescenza.

5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nelle aree delimitate. Il

materiale asportato dalla placca viene riunito in bevuta da 50 ml; si aggiungono 15 ml di cloroformio caldo, si agita bene e si filtra sull'imbuto a setto poroso trasferendo il gel di silice sul filtro stesso. Si lava per tre volte con porzioni di 10 ml di cloroformio caldo per volta, raccogliendo il filtrato in palloncino da 100 ml. Si evapora fino ad un volume di 4-5 ml, si trasferisce in provetta da centrifuga a fondo conico da 10 ml previamente tarata, si porta a secco con blando riscaldamento in corrente di azoto e si pesa.

5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri.
       Si procede come descritto al paragrafo 5.3 del metodo all'allegato V.

5.4. Analisi gascromatografica.

Si procede come descritto al paragrafo 5.4 del suddetto metodo. Le condizioni operative dell'analisi gascromatografica devono essere tali che, oltre a soddisfare i requisiti richiesti per l'analisi degli steroli, portino anche alla separazione dei TMSE dell'eritrodiolo e dell'uvaolo. Iniettato il campione si lascia svolgere la carta fino a che siano stati eluiti gli steroli presenti, l'eritrodiolo e l'uvaolo; si identificano quindi i picchi (l'eritrodiolo e l'uvaolo hanno tempi di ritenzione relativi, rispetto al b-sitosterolo, di circa 1,45 e 1,55 rispettivamente) e se ne calcolano le aree come detto per gli steroli.

 

6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Eritrodiolo, % = (A1 + A2) / (A1 + A2 + å Asteroli) * 100 in cui:

A1 = area del picco dell'eritrodiolo, in mm²,
A2 = area del picco dell'uvaolo, in mm²,
å Asteroli = somma delle aree degli steroli presenti, in mm².
Il risultato si esprime con una cifra decimale.

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